Práctica 3: Preparación de medios de cultivo

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO

Vamos a explicar la preparación de medios de cultivo en tubo inclinado, en placa de Petri y en tubos de ensayo. Prepararemos 250 ml de caldo nutritivo.

FUNDAMENTO

El medio de cultivo es lo que proporciona los nutrientes necesarios a los microorganismos. Su composición dependerá de la especie que se quiera cultivar, ya que cada una necesitará ciertos nutrientes. Existen microorganismos poco exigentes que son capaces de crecer bien en medios de laboratorio normales, y también existen microorganismos muy exigentes que necesitarán sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

MATERIAL

- Probeta
- Agua destilada
- Placas de Petri
- Vidrio de reloj
- Mechero Bunsen
- Autoclave
- Microondas
- Frasco de cristal con rosca
- Papel de filtro
- Pipeta
- Cremallera
- Tubos de ensayo
- Microondas
- Gradilla
- Varilla
-Embudo
- Caldo nutritivo

PROCEDIMIENTO:

1. Preparamos placas de Petri con  caldo nutritivo. En el bote del caldo nutritivo pone que son 8 gramos por litro, por lo que pesamos 2 gramos en un vidrio de reloj, ya que vamos a preparar 250ml.

2. Preparamos una probeta con 250ml de agua destilada.

3. Echamos el agua y el polvo de caldo nutritivo en un frasco. Vamos echando primero agua y luego polvo del caldo con ayuda de un embudo. Removemos con la varilla hasta que quede una mezcla homogénea y lo metemos al microondas hasta que alcance su punto de ebullición.

Si lo queremos hacer en tubos de ensayo, tras calentar el frasco debemos echar el caldo nutritivo en los tubos. Nosotros hemos echado 7ml en cada tubo de ensayo con la ayuda de una pipeta de 10ml. 

Si queremos hacerlo en tubo inclinado, cogemos tubos de ensayo largos y los llenamos con 10 ml cada uno con ayuda de una pipeta de 10 ml. 

4. Metemos el frasco o los tubos con tapón en el autoclave para esterilizarlo.

5. Dejamos que se enfríe un poco el caldo. En el caso de los tubos de ensayo, los metemos al frigorífico. Apilamos las placas de Petri que queremos llenar.

6. A continuación nos colocamos un guante que resista la temperatura del bote de cristal y tubos de ensayo para no quemarnos. Encendemos el mechero bunsen y comenzamos a echar caldo en las placas de Petri, esterilizando la boca del bote de cristal cada 2 placas de Petri que llenemos de caldo nutritivo. No tiene que empañarse.

Otra opción es hacerlo en la cabina de flujo laminar. Aquí las placas no se contaminan.

La cabina se enchufa 10min antes de empezar a trabajar. La luz UV descontamina la superficie, hay que ponerla al encenderla al principio del día y al apagarla al final del día, hay que tener cuidado y no trabajar con la luz UV puesta,  ya que se irrita la retina. Asegurarnos siempre de trabajar con la luz blanca. Descontaminamos la superficie de la cabina con algodón y alcohol,  antes y después de terminar de utilizarla. Abrimos las placas de Petri dentro de la cabina y empezamos a llenarla con el frasco de caldo de cultivo. 

Placas de Petri con caldo de cultivo en cabina de flujo laminar

Si lo hacemos en tubo inclinado, dejamos los tubos inclinados mas o menos 30°, no pueden moverse, deben mantenerse estables. 

Práctica 2: Tinción vital

Tinción vital

Objetivo: 

Observar microorganismos en una muestra de actimel realizando tinción con una preparación de 50 ml de azul de metileno 1:10000

Fundamento: 

Es un método de tinción que se usa para que células y estructuras adquieran contraste y puedan ser observadas. Nosotros queremos observar microorganismos vivos. Para conseguir el efecto deseado, se utiliza en disoluciones muy diluidas pues son sustancias muy tóxicas para los microorganismos. No es diferencial, cuando se usa el azul de metileno para teñir a los microorganismos, todos estos se tiñen por igual, se comporta de la misma manera con todos ellos.

Material:

⦁ Papel de filtro

⦁ Asa de siembra

⦁ Mechero Bunsen

⦁ Micropipeta

⦁ Azul de metileno

⦁ Embudo

⦁ Gradilla

⦁ Agua destilada

⦁ Actimel

⦁ Tubo de ensayo

⦁ Matraz aforado

⦁ Pipeta Pasteur

Procedimiento:

1.    Preparamos el material en el banco de trabajo, incluida la muestra de actimel en un tubo de ensayo.

2.    Introducimos agua destilada en un matraz aforado

3.    Cogemos 100 micro litros de azul de metileno con la micropipeta y los añadimos al matraz aforado.

4.    Con ayuda de un embudo, se completa el matraz aforado con agua destilada hasta llegar a los 50 ml.

5.    Colocamos una gota de suero salino en el porta con ayuda de una jeringa.

6.    Encendemos el mechero Bunsen para descontaminar el asa de siembra y crear un ambiente estéril. El asa la pasamos por la llama azul hasta que quede de color rojo vivo.

7.    Cogemos un inoculo de Actimel, lo colocamos en el portaobjetos y homogeneizamos.

8.    Colocamos una gota de azul de metileno con una pipeta Pasteur, volvemos a homogeneizar y extendemos por todo el porta.

9.    Ya tenemos nuestra muestra lista para ir a observarla al microscopio.

Resultados:

Los microorganismos se visualizarán vivos y ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro, y de color azul, en el caso de azul de metileno. Este último será nuestro caso, aunque no hemos conseguido distinguir bien a los organismos vivos.

Práctica 1: Observación en fresco de agua estancada y técnica de la gota pendiente

Observación en fresco de agua estancada y técnica de la gota pendiente

Objetivo: 

    Observación al microscopio de los microorganismos presentes en la muestra, tanto en fresco como mediante la gota pendiente.

Fundamento:  

     Vamos a realizar la observación mediante dos técnicas diferentes: La primera la realizaremos sobre un portaobjetos normal, luego probaremos a hacerlo en un portaobjetos excavado, ocupándonos de que la gota se quede en la zona excavada, esta última técnica se denomina gota pendiente. Así haremos observaciones de ambas muestras. La observación hay que realizarla lo antes posible tras obtener la muestra, pues si no, esta se desecará y sólo veremos microorganismos inertes.

   Material y reactivos:

        1.     Portaobjetos estándar

        2.     Portaobjetos excavado

        3.     Cubreobjetos

        4.     Pipeta Pasteur

        5.     Aceite del microscopio

        6.     Vaso de precipitados con la muestra de agua estancada

        7.     Microscopio

        8.     Alcohol

        9.     Papel de filtro

    Protocolo:

        1.     Se prepara el área de trabajo colocando el papel de filtro y el material que necesitaremos en ese momento sobre la mesa, que será: Ambos portaobjetos (estándar y excavado), pipeta pasteur, muestra de agua estancada, aceite del microscopio y el cubreobjetos.

        2.     Con la pipeta pasteur se recoge un poco de la muestra y se coloca una gota sobre el portaobjetos estándar, a continuación, se coloca el cubreobjetos encima. Y ya puedes ir a la zona de microscopía a observarla.

           Gota pendiente:

          1.     Colocar muy poca cantidad de aceite del microscopio en los bordes o esquinas del cubreobjetos. Luego se echa la gota en la zona central de este, con cuidado de que no se mezcle el aceite con la gota (por eso hay que echar muy poca cantidad de aceite).

          2.       Finalmente se coloca encima el portaobjetos excavado, asegurándose de que la gota queda en la zona excavada. Ya podemos ir a la zona de microscopía a observar la muestra.

  

    Interpretación de los resultados:

  

     En la primera imagen podemos observar un Paramecio, es un protozoo ciliado que tiene forma ovalada, se suele encontrar en agua dulce estancada y que contenga algo de materia orgánica. Son los protozoos ciliados mejor estudiados de la ciencia.

        En la segunda imagen podemos observar un gusano cobra (nemátodo), su cuerpo es muy pequeño y afilado, son muy resistentes pues tienen una coraza flexible, lisa y transparente. Pueden encontrarse tanto en agua dulce como en agua salada, además, pueden vivir prácticamente a cualquier profundidad. Cuando las condiciones no son favorables se pueden enquistar y sobrevivir hasta que lleguen unas condiciones más favorables para ellos.

    En la última imagen, tenemos una pulga de agua que cogí intencionadamente con la pipeta pasteur. Las pulgas de agua pertenecen al grupo de los branquiópodos pues respiran a través de las branquias de sus patas, se mueven a saltos, nadando siempre al revés. Casi todos viven en agua dulce, aunque esté un poco salada. Muy pocas especies se han atrevido a lanzarse a los mares. Frecuentemente sobreviven en charcas pues sus huevos son muy resistentes. Esta última la observé en una práctica anterior.