Práctica 9: Descripción macroscópica de colonias

DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA DE COLONIAS

Fundamento:

Cuando una bacteria se deposita sobre un medio de cultivo sólido y se incuba en condiciones adecuadas, se multiplica de forma exponencial, de manera que al cabo de varias horas genera un acúmulo de células visibles macroscópicamente en el sitio de la inoculación, que recibe el nombre de colonia.

Una colonia bacteriana es un conjunto o agrupación de bacterias crecidas sobre un medio de cultivo sólido, procedente de una unidad formadora de colonias. (UFC).

Una unidad formadora de colonias es una bacteria o agrupamiento de bacterias, que inoculadas sobre un medio de cultivo sólido son capaces de producir una colonia.

La morfología de una colonia es característica de cada especie. El análisis morfológico se realiza 24 horas después de la inoculación. En algunas especies de crecimiento lento hay que esperar varios días, incluso semanas.

Parámetro	Tipos
Tamaño	0,5 mm hasta varios milímetros a las 24 horas.
Forma (plano transversal)	Puntiforme Circular Fusiforme Irregular Rizoide Filamentosa
Forma (plano sagital)	Plana Convexa Planoconvexa Umbilicada Papilar
Borde	Liso Ondulado Lobulado Rugoso
Superficie	Lisa Estriada Amorfa Granular Brillante Mate
Coloración	Muy variada, dependiendo de la producción de pigmentos.
Consistencia	Dura Cremosa Mucosa Pegajosa

Práctica 8: Técnicas de siembra

TÉCNICAS DE SIEMBRA

Objetivo:

Comparar la unidad práctica de cada uno de los métodos de siembra con respecto al crecimiento observado tanto en medio sólido como en medio líquido.

Fundamento:

La siembra es el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido. Toda siembra, inoculación o resiembra se puede realizar de diferentes formas según las características de la muestra. La siembra se puede realizar en medios líquidos y en medios sólidos.

Material:

- Muestra problema

- Asa de siembra, escobillón o hisopo

- Gradilla

- Mechero Bunsen

Procedimiento de siembra en medio líquido

- Si se realiza con el asa de siembra, esta se carga con la muestra problema sólida o líquida en condiciones de esterilidad y se adiciona al medio líquido agitandola.

- Si se realiza con pipeta, se toma un volumen de muestra problema y se vierte en el medio de cultivo líquido agitandose hasta su homogeneización.

- Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra

Procedimiento de siembra en medio sólido

- Siembra por agotamiento de asa en estrias

1. Se toma muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de esta.

2. Flameamos el asa de siembra y giramos ligeramente la placa repitiendo el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa.

3. Se vuelve a flamear el asa sin coger muestra (como en el caso anterior) y siguiendo la misma dirección se repite la operación hasta un total de 4 o 5 veces.

4. El último tramo se realiza hacia el interior de la placa.

- Siembra por agotamiento de asa en zigzag

1. Se toma muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de esta hasta ocupar un tercio de su superficie

2. Sin flamear el asa de siembra, giramos ligeramente la placa repitiendo el proceso anterior.

3. Siguiendo la misma dirección se repite la operación de nuevo.

4. El último tramo se realiza hacia el interior de la placa.

Las líneas no se tocan entre ellas

- Siembra mediante la técnica de los 4 cuadrantes:

1. Con un rotulador se dibujan dos lineas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa, de tal forma que esta quede dividida en 4 cuadrantes.

2. Se toma con el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiendose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag.

3. Realizamos la misma operación sin flamear en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema.

Resultados:

- Medio líquido: Un organismo se disemina de la linea de inoculación a toda la masa de Agar hasta la pared del tubo de ensayo, con lo que se produce turbidez en el medio de cultivo.

- Medio sólido por agotamiento: El resultados serán colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando más la muestra.

- Medio sólido por técnica de 4 cuadrantes: En cada cuadrante se observarán las colonias más y más aisladas, por lo que en el cuarto cuadrante es dónde se observarán las colonias más aisladas o separadas.

Práctica 7: Tinción de Ziehl - Neelsen

TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

Objetivo:

Diferenciar tipos bacterianos capaces de resistir la decoloración ácida, hecho que es debido a la gran cantidad de componentes micólicos que forman parte de la pared bacteriana de este tipo de bacterias.

Fundamento:

Existen determinados grupos bacterianos que contienen en su pared una gran cantidad de componentes lipoideos y cereos, de tal forma que este tipo de bacterias presentarán grandes dificultades a la hora de teñirse con los colorantes convencionales que no pueden penetrar en el interior de estas bacterias. Por eso se necesitan colorantes altamente concentrados y la presencia de calor que facilite su penetración al interior de dichas bacterias. Una vez que estas bacterias han quedado teñidas no se pueden decolorar, resisten incluso a decoloraciones ácidas. Aprovechando esto, podemos diferenciar este tipo de bacterias, como es el caso del género Mycobacterium, del resto que no presenta esta propiedad. Las que sean resistentes quedarán de color rosa, pues resisten la decoloración con alcohol ácido, las no resistentes quedarán de color azul.

Lo haremos mediante la tinción de Ziehl – Neelsen, una tinción diferencial, en la que se utiliza la fucsina fenicada en caliente para que pueda penetrar en la pared de las bacterias BAAR (ácido resistentes) pues dicha pared es fluidificada debido al calor A continuación, aplicamos alcohol ácido sobre la extensión, los ácidos micólicos y las ceras de la pared de las bacterias ácido resistentes, se vuelven a solidificar, atrapando el colorante e impidiendo que la mezcla de alcohol ácido decolore la bacteria. Al final de esta fase, las bacterias ácido resistentes quedarán coloreadas de rosa debido a la fucsina fenicada, y las que se han decolorado estarán incoloras. Finalmente, echamos el colorante de contraste, azul de metileno, el cual no podrá penetrar la pared de las bacterias ácido resistentes, pero si a las demás bacterias. Quedando de esta manera las bacterias que no son resistentes al ácido de color azul, y las que sí lo son, de color rosa.

Este tipo de tinción se suele utilizar para diagnosticar y estudiar las enfermedades producidas por bacterias ácido-resistentes, como la tuberculosis y la lepra.

Material:

- Portaobjetos

- Pinzas de madera

- Asa de siembra

- Mechero Bunsen

- Pipeta Pasteur

- Cristalizador

- Asa de tinciones

- Frasco lavador

- Muestra problema

- Aceite de inmersión

- Solución fenicada de fucsina básica

- Solución hidroalcohólica de azul de metileno

- Alcohol ácido al 3%.

Procedimiento:

1. Realizar preparación con su correspondiente fijación.

2. Cubrir la preparación con fucsina fenicada básica durante 5 minutos aplicando calor en este tiempo con una torunda hasta la emisión de vapores, evitando que se caliente demasiado o que se seque el colorante.

3. Lavar abundantemente con agua destilada hasta arrastrar el colorante, con cuidado de no llevarnos la muestra de por medio.

4. Decolorar en frío con alcohol ácido hasta arrastrar los restos de colorante (2 minutos).

5. Lavar abundantemente con agua destilada.

6. Cubrir la preparación con colorante de contraste, nosotros hemos utilizado azul de metileno, dejar 2 minutos sin necesidad de calentar.

7. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

Resultados e interpretación

Hemos realizado esta tinción en 4 muestras. Nuestras 2 muestras de estudio: 5 y 8. Y en dos muestras proporcionadas por el profesor, rotuladas con AAR 1 y AAR 2.

Los resultados son los siguientes:

- AAR 1: Podemos observar bacilos y entre ellos se han situado esporas. Se quedan de color azul, esto quiere decir que no son ácido resistentes, ya que conservan el colorante de contraste.

- AAR 2: Hay bacilos ácido resistentes, pues aparecen de color rosa.

- Muestra 5: No hay bacilos ácido resistentes, ya que han sido decolorados y coloreados con el colorante de contrastes, azul de metileno.

- Muestra 8: Mayoritariamente encontramos bacilos sin ácido resistencia, pero hemos encontrado algunos de color rosa, lo que indica que su pared es ácido resistente pues no ha sido decolorada con el alcohol ácido.

En esta tinción hemos observado bacilos de color rosa que indican ácido alcohol resistencia positiva, es decir, son resistentes a la decoloración ácida (característica del género de Mycobacterium y algunas especies de Nocardia). Así, los bacilos se diferencian del resto de bacterias que no presentan esta propiedad y que se tiñen entonces con azul de metileno presentando color azul.

Práctica 6: Tinción de esporas (Método de Wirtz o verde malaquita)

Tinción de esporas (Método de Wirtz o verde malaquita)

Objetivo:

Evidenciar estructuras de resistencia o esporas propias de algunos grupos bacterianos, como sería el caso de los géneros Nacillus y Clostridium. Vamos a determinar esto en cuatro muestras:

-  Muestra 5

-  Muestra 8

-  ESP 1 (proporcionada por el profesor)

-  ESP 2 (proporcionada por el profesor)

Fundamento:

Las esporas son estructuras bacterianas que se forman en condiciones adversas por parte de ciertas bacterias. Tales esporas son capaces de resistir situaciones muy desfavorables, de ahí su denominación de resistencia. En general, las esporas se tiñen muy difícilmente, requiriendo determinados colorantes muy concentrados, así como la presencia de calor que facilite su penetración. Aunque una vez teñidas es muy difícil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder demostrar la presencia de estas.

Para poder observar claramente los bacilos, vamos a hacer que esporulen, y luego vamos a aplicar una técnica de tinción de esporas llamada Método de Wirtz o verde malaquita. Para hacer que los bacilos esporulen, tenemos que someterlos a un gran estrés.

Material:

• Mechero Bunsen
• Asa de siembra
• Cultivo
• Torunda
• Suero salino
• Puente de tinción
• Verde malaquita
• Portaobjetos
• Pinzas
• Microscopio

Procedimiento:

1. Colocamos una gota de suero salino en el portaobjetos.

2. Encendemos el mechero Bunsen para trabajar en un ambiente estéril. esterilizamos asa de siembra con mechero y recogemos el inóculo de la placa, enfriando antes en una esquina.

3. Homogeneizamos con la gota de suero salino de portaobjetos.

4. Enganchamos el portaobjetos con una pinza y lo pasamos por encima de la llama hasta que se fije.

5. Preparamos la torunda: Envolvemos los extremos de una especie de alambre con algodón, le colocamos una gasa de tela, y usamos esparadrapo para cerrarlo.

6. Nos llevamos el porta al lavabo y lo colocamos en el puente de tinción.

7. Cubrimos la extensión con el colorante verde malaquita al 5%

8. Echamos en la torunda alcohol y la prendemos.

9. Usamos la torunda para aplicar calor por la zona de abajo de los portas durante 5 minutos, con cuidado de no romper el portaobjetos y de que el colorante no entre en ebullición o se seque.

10. Lavamos abundantemente con agua destilada el exceso de colorante

11. Cubrimos la extensión con safranina al 0,5%, dejándolo así durante 2 o 3 minutos. Este será el colorante de contraste.

12. Volvemos a lavar y dejamos secar.

13. Nos vamos al microscopio a observar nuestros bacilos esporulados.

Resultados e interpretación:

Hemos observado en el microscopio esporas teñidas de verde, y células vegetativas teñidas de rosa.

ESP 1: Observamos los bacilos de color rosa, lo que quiere decir que el resultado será negativo, no hay presencia de esporas. Forman ramificaciones.

Muestra 8: Se pueden observar estructuras de color verde, eso pone de manifiesto la presencia de esporas. Forman agrupaciones empalizadas y de letras chinas.

ESP 2:  Vemos bacilos en agrupaciones en caña de bambú y empalizados, son de color rosa, por lo que no producen esporas. Hay otros de color verde que sí producirán, pero no forman ninguna agrupación. Se pueden observar de manera homogénea ambos tipos.

Muestra 5: Los bacilos verdes forman agrupaciones de letras chinas (giro inferior a 180º), producen esporas. Hay algunos bacilos rosas que forman cadenas en caña de bambú, pero son minoritarios. En esta muestra destaca la presencia de bacilos que esporulan.

Práctica 5: Toma de muestras y cultivos en medio líquido

Toma de muestras y cultivos en medio líquido

Objetivo:

Realizar un cultivo de microorganismos en un medio de cultivo líquido.

Fundamento:

Las muestras se toman con hisopos, que son una especie de varillas con un algodón en un extremo. Nosotros recogeremos muestras bucales.

Material:

• Hisopos
• Medio de cultivo líquido
• Mechero Bunsen
• Tijeras
• Gradilla

Procedimiento:

1. Encendemos el mechero Bunsen para trabajar en ambiente estéril.
2. Preparamos medios de cultivo líquidos en sus respectivos tubos.
3. Se toma la muestra con el hisopo y se introduce en el medio líquido, cortando el hisopo. (Se esteriliza el tubo tanto cuando lo abres como cuando lo cierras)

Práctica 4: Tinción de Gram

TINCIÓN DE GRAM

Objetivo:

Visualizar diferentes tipos bacterianos en función de la distinta composición de su pared bacteriana. También visualizar su morfología y su disposición.

Fundamento:

Este método es empleado para clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: gram+ y gram-. El comportamiento de estas bacterias ante la tinción de gram se debe a la composición de la pared de las células bacterianas.

Esta tinción se basa en emplear un primer colorante básico como el cristal violeta, que teñirá de azul a todas las bacterias. Luego se aplica lugol para que el cristal violeta se fije a las bacterias, aumentando la afinidad entre el colorante y las células bacterianas. Se usa un decolorante, ante este se desteñirán las bacterias gram negativas, cuya membrana externa será disuelta por dicho decolorante (alcohol/acetona).Las bacterias gram positivas tienen una membrana gruesa que, es resistente durante más tiempo y  es capaz de retener el cristal violeta. Importante respetar el tiempo de decoloración, pues si se prolonga de más, es probable que se decoloren también las gram positivas.

Finalmente, utilizamos la safranina que será el colorante de contraste que dará color a las gram negativas que se han desteñido previamente. Las gram positivas quedarán teñidas por el cristal violeta de color azul. De esta forma podremos distinguir a la perfección estos dos grandes grupos.

Material:

·         Portaobjetos para realizar el frotis.

·         Pinzas para facilitar fijación por calor.

·         Asa de siembra

·         Mechero Bunsen

·         Pipeta Pasteur

·         Cristalizador

·         Asa de tinciones

·         Frasco lavador

·         Muestra problema

·         Aceite de inmersión

·         Colorantes

·         Microscopio

·         Cristal violeta

·         Lugol

·         Safranina

Procedimiento:

1. Colocamos una gota de suero salino en el portaobjetos.

2. Encendemos el mechero Bunsen para trabajar en un ambiente estéril. Esterilizamos asa de siembra con mechero y recogemos el inóculo del tubo con nuestra muestra, enfriando antes en una esquina.

3. Homogeneizamos con la gota de suero salino de portaobjetos.

4. Enganchamos el portaobjetos con una pinza y lo pasamos por encima de la llama hasta que se fije.

  

5. Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante, que será el cristal violeta. Se deja 1 minuto.

6. Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Es importante que el lavado sea breve, porque el cristal violeta sin mordiente es soluble en agua y se corre el riesgo de decolorar las bacterias

7. Aplicar el lugol para fijar el colorante anterior, aplicándose durante 1 minuto. Se vuelve a lavar abundantemente con agua destilada.

9. Decolorar con alcohol/acetona 1:1 durante 30 segundos. Se puede utilizar también alcohol de 90º. Se vuelve a lavar con agua destilada y se escurre.

10. Cubrir portaobjetos con el segundo colorante, la safranina, durante 2 minutos.

11. Se lava y se deja secar.

12. Observar con objetivo de inmersión.

Resultados:

Interpretación:

En la imagen podemos distinguir en azul las gram positivas y en rosa las gram negativas. En nuestra muestra hemos observado sobre todo bacterias gram positivas de color rosa.