Práctica 4: Tinción de Gram

TINCIÓN DE GRAM

Objetivo:

Visualizar diferentes tipos bacterianos en función de la distinta composición de su pared bacteriana. También visualizar su morfología y su disposición.

Fundamento:

Este método es empleado para clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: gram+ y gram-. El comportamiento de estas bacterias ante la tinción de gram se debe a la composición de la pared de las células bacterianas.

Esta tinción se basa en emplear un primer colorante básico como el cristal violeta, que teñirá de azul a todas las bacterias. Luego se aplica lugol para que el cristal violeta se fije a las bacterias, aumentando la afinidad entre el colorante y las células bacterianas. Se usa un decolorante, ante este se desteñirán las bacterias gram negativas, cuya membrana externa será disuelta por dicho decolorante (alcohol/acetona).Las bacterias gram positivas tienen una membrana gruesa que, es resistente durante más tiempo y  es capaz de retener el cristal violeta. Importante respetar el tiempo de decoloración, pues si se prolonga de más, es probable que se decoloren también las gram positivas.

Finalmente, utilizamos la safranina que será el colorante de contraste que dará color a las gram negativas que se han desteñido previamente. Las gram positivas quedarán teñidas por el cristal violeta de color azul. De esta forma podremos distinguir a la perfección estos dos grandes grupos.

Material:

·         Portaobjetos para realizar el frotis.

·         Pinzas para facilitar fijación por calor.

·         Asa de siembra

·         Mechero Bunsen

·         Pipeta Pasteur

·         Cristalizador

·         Asa de tinciones

·         Frasco lavador

·         Muestra problema

·         Aceite de inmersión

·         Colorantes

·         Microscopio

·         Cristal violeta

·         Lugol

·         Safranina

Procedimiento:

1. Colocamos una gota de suero salino en el portaobjetos.

2. Encendemos el mechero Bunsen para trabajar en un ambiente estéril. Esterilizamos asa de siembra con mechero y recogemos el inóculo del tubo con nuestra muestra, enfriando antes en una esquina.

3. Homogeneizamos con la gota de suero salino de portaobjetos.

4. Enganchamos el portaobjetos con una pinza y lo pasamos por encima de la llama hasta que se fije.

  

5. Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante, que será el cristal violeta. Se deja 1 minuto.

6. Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Es importante que el lavado sea breve, porque el cristal violeta sin mordiente es soluble en agua y se corre el riesgo de decolorar las bacterias

7. Aplicar el lugol para fijar el colorante anterior, aplicándose durante 1 minuto. Se vuelve a lavar abundantemente con agua destilada.

9. Decolorar con alcohol/acetona 1:1 durante 30 segundos. Se puede utilizar también alcohol de 90º. Se vuelve a lavar con agua destilada y se escurre.

10. Cubrir portaobjetos con el segundo colorante, la safranina, durante 2 minutos.

11. Se lava y se deja secar.

12. Observar con objetivo de inmersión.

Resultados:

Interpretación:

En la imagen podemos distinguir en azul las gram positivas y en rosa las gram negativas. En nuestra muestra hemos observado sobre todo bacterias gram positivas de color rosa.