Práctica 6: Tinción de esporas (Método de Wirtz o verde malaquita)

Tinción de esporas (Método de Wirtz o verde malaquita)

Objetivo:

Evidenciar estructuras de resistencia o esporas propias de algunos grupos bacterianos, como sería el caso de los géneros Nacillus y Clostridium. Vamos a determinar esto en cuatro muestras:

-  Muestra 5

-  Muestra 8

-  ESP 1 (proporcionada por el profesor)

-  ESP 2 (proporcionada por el profesor)

Fundamento:

Las esporas son estructuras bacterianas que se forman en condiciones adversas por parte de ciertas bacterias. Tales esporas son capaces de resistir situaciones muy desfavorables, de ahí su denominación de resistencia. En general, las esporas se tiñen muy difícilmente, requiriendo determinados colorantes muy concentrados, así como la presencia de calor que facilite su penetración. Aunque una vez teñidas es muy difícil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder demostrar la presencia de estas.

Para poder observar claramente los bacilos, vamos a hacer que esporulen, y luego vamos a aplicar una técnica de tinción de esporas llamada Método de Wirtz o verde malaquita. Para hacer que los bacilos esporulen, tenemos que someterlos a un gran estrés.

Material:

• Mechero Bunsen
• Asa de siembra
• Cultivo
• Torunda
• Suero salino
• Puente de tinción
• Verde malaquita
• Portaobjetos
• Pinzas
• Microscopio

Procedimiento:

1. Colocamos una gota de suero salino en el portaobjetos.

2. Encendemos el mechero Bunsen para trabajar en un ambiente estéril. esterilizamos asa de siembra con mechero y recogemos el inóculo de la placa, enfriando antes en una esquina.

3. Homogeneizamos con la gota de suero salino de portaobjetos.

4. Enganchamos el portaobjetos con una pinza y lo pasamos por encima de la llama hasta que se fije.

5. Preparamos la torunda: Envolvemos los extremos de una especie de alambre con algodón, le colocamos una gasa de tela, y usamos esparadrapo para cerrarlo.

6. Nos llevamos el porta al lavabo y lo colocamos en el puente de tinción.

7. Cubrimos la extensión con el colorante verde malaquita al 5%

8. Echamos en la torunda alcohol y la prendemos.

9. Usamos la torunda para aplicar calor por la zona de abajo de los portas durante 5 minutos, con cuidado de no romper el portaobjetos y de que el colorante no entre en ebullición o se seque.

10. Lavamos abundantemente con agua destilada el exceso de colorante

11. Cubrimos la extensión con safranina al 0,5%, dejándolo así durante 2 o 3 minutos. Este será el colorante de contraste.

12. Volvemos a lavar y dejamos secar.

13. Nos vamos al microscopio a observar nuestros bacilos esporulados.

Resultados e interpretación:

Hemos observado en el microscopio esporas teñidas de verde, y células vegetativas teñidas de rosa.

ESP 1: Observamos los bacilos de color rosa, lo que quiere decir que el resultado será negativo, no hay presencia de esporas. Forman ramificaciones.

Muestra 8: Se pueden observar estructuras de color verde, eso pone de manifiesto la presencia de esporas. Forman agrupaciones empalizadas y de letras chinas.

ESP 2:  Vemos bacilos en agrupaciones en caña de bambú y empalizados, son de color rosa, por lo que no producen esporas. Hay otros de color verde que sí producirán, pero no forman ninguna agrupación. Se pueden observar de manera homogénea ambos tipos.

Muestra 5: Los bacilos verdes forman agrupaciones de letras chinas (giro inferior a 180º), producen esporas. Hay algunos bacilos rosas que forman cadenas en caña de bambú, pero son minoritarios. En esta muestra destaca la presencia de bacilos que esporulan.