Práctica 12: Siembra en placas de agar sangre, McConkey y Levine

SIEMBRA EN PLACAS DE AGAR MCCONKEY, AGAR SANGRE Y LEVINE

Objetivo:

Realizar una siembra por agotamiento en agar sangre, McConkey y Levine.

Fundamento:

-       Agar sangre: Se utiliza para observar la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos. También para estimular el crecimiento de Streptococcus. Según el tipo de hemolisis que posea son: alfa (halos verdosos), beta (halos incoloros) y gamma (inexistencia de halos).

-       Agar McConkey: Es un medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para aislar selectivamente bacilos gram negativos y entéricos. Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

-       Agar Levine: Se utiliza para diferenciación y aislamiento de E. Coli. Medio adecuado para el crecimiento de enterobacterias. Permite diferencias las bacterias fermentadoras de lactosa de las que no la fermentan.

Material:

-       Asa de siembra

-       Gradilla

-       Mechero Bunsen

-       Placa con agar sangre

-       Placa con agar Levine

-       Placa con agar McConkey

-       Papel de filtro

-       Muestras 5 y 8

Procedimiento:

    1. Preparar el material de trabajo.

2  2. Rotular placas con fecha, numero de muestra y grupo de trabajo.

3  3. Encender el mechero Bunsen

4  4. Esterilizar asa de siembra, enfriar en una esquina en la que no hayan microorganismos, y tomar muestra de cada tubo (5 y 8).

5  5. Realizar una siembra por agotamiento.

6  6. Realizar operación anterior en las 3 placas.

Resultados e interpretación:

En el agar sangre hemos sembrado la muestra 5, tras 48 horas de incubación, hemos observado que el resultado es Beta hemólisis.

Práctica 16: Siembra en medio KIA y prueba del agar hierro de Kliger

SIEMBRA EN MEDIO KIA Y PRUEBA DEL AGAR HIERRO KLIGER

FUNDAMENTO:

Esta es una prueba combinada que se usa para la diferenciación de enterobacterias y que permite determinar diversos parámetros, como la capacidad del microorganismo de metabolizar glucosa y lactosa, y la producción o no de gas como producto final del metabolismo de los carbohidratos, y la producción de ácido sulfhídrico.

El medio Kliger contiene diversos componentes entre los cuales destacan:

-       Glucosa y lactosa, como carbohidratos.

-       Indicador de rojo fenol, que vira amarillo en medio ácido

-       Tiosulfato de sodio, que es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico.

OBJETIVO:

Diferenciar enterobacterias

MATERIAL:

-       Medio KIA en tubo inclinado

-       Tubo de ensayo

-       Gradilla

-       Asa de siembra

-       Muestras 5 y 8

-       Mechero Bunsen

PROCEDIMIENTO:

1.    Sembrar en el medio de cultivo nuestras muestras 5 y 8, un medio para cada muestra. Se realiza picando en el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

2.    Incubar durante 24 horas a 2ºC en anaerobiosis.

3.    Efectuar la lectura

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Muestra 5: Pico y fondo rojo, es decir, la bacteria no es fermentadora de azúcares. No se ha producido ennegrecimiento del medio, la bacteria no produce ácido sulfhídrico. Tampoco hay burbujas, la bacteria no produce gas.

Muestra 8: Pico y fondo rojo, ennegrecimiento del medio y burbujas. La bacteria no fermenta azúcares, produce ácido sulfhídrico y gas.

PRUEBAS IMViC

Práctica 17: Prueba de la coagulasa

PRUEBA DE LA COAGULASA

FUNDAMENTO:

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta proteína también es producida por Yersinia pestis.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del estafilococo es capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.

OBJETIVO:

La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus Aureus  del Coagulase Negative Staphylococcus. S.aureus produce 2 formas de coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo. Nosotros haremos la segunda.

MATERIAL:

-       Plasma

-       Mechero Bunsen

-       Asa de siembra

-       Gradilla

-       Tubo de hemolisis

-       Muestras 5 y 8

-       Baño María

-       Pipeta Pasteur

PROCEDIMIENTO:

1. Introducir un poco de plasma en un tubo de hemólisis.

2. Tomar inóculo de la muestra

3. Homogenizar con el plasma lentamente

4. Incubar tubos en baño maría a 37º durante 30 minutos.

5. Realizar lectura cada cierto tiempo para ver si se forma o no el coágulo. Si pasadas 4 horas no lo ha hecho, damos la prueba como negativa.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Muestra 8: Se ha formado el coágulo, por lo que la prueba será positiva.

Muestra 5: No se ha formado el coágulo, la prueba es negativa.

Práctica 15: Prueba buiquímica de la potasa

PRUEBA DE LA POTASA

Objetivo:

Es una prueba bioquímica que se utiliza para distinguir las bacterias gram – de las gram +. Ahorra mucho tiempo, pues es más rápido que realizar la tinción de gram en sí.

Fundamento:

El hidróxido de potasio disuelve la pared de lipopolisacáridos de las bacterias gram -. Si al mezclar la carga bacteriana con el hidróxido de potasio al 3%, se forma una masa espesa y pegajosa que se pega al asa de siembra, entonces indicará que es gram -.

Material:

  - Asa de siembra

-       - Mechero Bunsen

-       - Portaobjetos

-       - KOH al 3%

-       - Muestras 5 y 8

-       - Gradilla

-       - Agua destilada

-       - Matraz de 100 ml

-       - Balanza

-       - Pipeta Pasteur

-       - Vidrio de reloj.

Procedimiento:

1. Preparar el espacio de trabajo

2. Machacar el KOH para disminuir el tamaño de los granos

3. Pesar un poco más de 3,33 gramos

4. Echar agua destilada de base en el matraz.

5. Ir echando el KOH y removiendo, mientras se va echando más agua destilada.

6. Enrasar con la pipeta Pasteur hasta 100 ml.

7. Cogemos una gota de la solución realizada anteriormente y la depositamos en el portaobjetos.

8. Coger carga bacteriana con el asa de siembra de nuestra muestra. Esterilizando el asa y enfriando en un esquina.

9. Homogeneizar con la gota de KOH

Resultados e interpretación:

No hay ningún hilillo ni mucosa, por lo que la prueba será negativa para ambas muestras.

Práctica 14: Prueba de la oxidasa.

PRUEBA DE LA OXIDASA

Objetivo:

Poner la colonia en contacto con fenilendiamina para saber si sintetiza oxidasa, lo cual se manifiesta con un cambio de color. En este caso, el reactivo se presentará en tiras de papel absorbente con una zona reactiva.

Fundamento:

La oxidasa es la enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato de oxígeno. Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de ATP, el oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie microbiana.

Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella. Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia del enzima “citocromo oxidasa” en el microorganismo, el cual cataliza el último paso de transferencia de electrones desde un substrato inorgánico al oxígeno. Para ello se observa el cambio de color de un indicador de PH incoloro cuando está reducido y coloreado cuando se oxida. Entre los indicadores más utilizados se encuentran p-fenilendiamina, que por acción del citocromo oxidasa, da un compuesto químico indofenol que tiene color.

Material:

  - Asa de siembra

-       - Tiras reactivas impregnadas de fenilendiamina

-       - Mechero Bunsen

-       - Muestras 5 y 8

Procedimiento:

1. Preparar espacio de trabajo.

2. Esterilizar asa de siembra, enfriar en una zona sin colonias y coger inoculo bacterias.

3.  Depositar bacterias en la tira reactiva

Resultados e interpretación:

La tira no se ha coloreado de azul por lo que las pruebas serán negativas.

Práctica 13: Prueba de la catalasa

PRUEBA DE LA CATALASA

Objetivo:

La prueba consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una colonia bacteriana y observar si se forman burbujas.

Fundamento:

La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo.

El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de los hidratos de carbono.

La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndolo en agua y oxígeno gas. Si acumulase el peróxido de hidrógeno en los microorganismos, estos morirían, por ello es fundamental la presencia de microorganismos de la catalasa. El peróxido de hidrógeno se libera formando burbujas.

Material:

-       - Asa de siembra

-       - Mechero Bunsen

-       - Muestras 5 y 8

-       - Dos tubos de ensayo

-       - Peróxido de hidrógeno

-       - Dos portaobjetos

Procedimiento:

1  1. Preparar lugar de trabajo

2  2. Echar agua oxigenada en los tos tubos de ensayo y una gota en cada portaobjetos.

3  3. Esterilizar asa de siembra, enfrar en una esquina en la que no hayan colonias y coger bacterias.

   4. Depositar dentro del tubo de ensayo u homogeneizar en el portaobjetos con la gota. De ambas maneras es válida la prueba.

Resultados e interpretación:

No han salido burbujas en ninguna, por lo que la prueba será negativa.