PRUEBAS IMViC

Práctica 17: Prueba de la coagulasa

PRUEBA DE LA COAGULASA

FUNDAMENTO:

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta proteína también es producida por Yersinia pestis.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del estafilococo es capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.

OBJETIVO:

La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus Aureus  del Coagulase Negative Staphylococcus. S.aureus produce 2 formas de coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo. Nosotros haremos la segunda.

MATERIAL:

-       Plasma

-       Mechero Bunsen

-       Asa de siembra

-       Gradilla

-       Tubo de hemolisis

-       Muestras 5 y 8

-       Baño María

-       Pipeta Pasteur

PROCEDIMIENTO:

1. Introducir un poco de plasma en un tubo de hemólisis.

2. Tomar inóculo de la muestra

3. Homogenizar con el plasma lentamente

4. Incubar tubos en baño maría a 37º durante 30 minutos.

5. Realizar lectura cada cierto tiempo para ver si se forma o no el coágulo. Si pasadas 4 horas no lo ha hecho, damos la prueba como negativa.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Muestra 8: Se ha formado el coágulo, por lo que la prueba será positiva.

Muestra 5: No se ha formado el coágulo, la prueba es negativa.

Práctica 15: Prueba buiquímica de la potasa

PRUEBA DE LA POTASA

Objetivo:

Es una prueba bioquímica que se utiliza para distinguir las bacterias gram – de las gram +. Ahorra mucho tiempo, pues es más rápido que realizar la tinción de gram en sí.

Fundamento:

El hidróxido de potasio disuelve la pared de lipopolisacáridos de las bacterias gram -. Si al mezclar la carga bacteriana con el hidróxido de potasio al 3%, se forma una masa espesa y pegajosa que se pega al asa de siembra, entonces indicará que es gram -.

Material:

  - Asa de siembra

-       - Mechero Bunsen

-       - Portaobjetos

-       - KOH al 3%

-       - Muestras 5 y 8

-       - Gradilla

-       - Agua destilada

-       - Matraz de 100 ml

-       - Balanza

-       - Pipeta Pasteur

-       - Vidrio de reloj.

Procedimiento:

1. Preparar el espacio de trabajo

2. Machacar el KOH para disminuir el tamaño de los granos

3. Pesar un poco más de 3,33 gramos

4. Echar agua destilada de base en el matraz.

5. Ir echando el KOH y removiendo, mientras se va echando más agua destilada.

6. Enrasar con la pipeta Pasteur hasta 100 ml.

7. Cogemos una gota de la solución realizada anteriormente y la depositamos en el portaobjetos.

8. Coger carga bacteriana con el asa de siembra de nuestra muestra. Esterilizando el asa y enfriando en un esquina.

9. Homogeneizar con la gota de KOH

Resultados e interpretación:

No hay ningún hilillo ni mucosa, por lo que la prueba será negativa para ambas muestras.

Práctica 14: Prueba de la oxidasa.

PRUEBA DE LA OXIDASA

Objetivo:

Poner la colonia en contacto con fenilendiamina para saber si sintetiza oxidasa, lo cual se manifiesta con un cambio de color. En este caso, el reactivo se presentará en tiras de papel absorbente con una zona reactiva.

Fundamento:

La oxidasa es la enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato de oxígeno. Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de ATP, el oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie microbiana.

Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella. Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia del enzima “citocromo oxidasa” en el microorganismo, el cual cataliza el último paso de transferencia de electrones desde un substrato inorgánico al oxígeno. Para ello se observa el cambio de color de un indicador de PH incoloro cuando está reducido y coloreado cuando se oxida. Entre los indicadores más utilizados se encuentran p-fenilendiamina, que por acción del citocromo oxidasa, da un compuesto químico indofenol que tiene color.

Material:

  - Asa de siembra

-       - Tiras reactivas impregnadas de fenilendiamina

-       - Mechero Bunsen

-       - Muestras 5 y 8

Procedimiento:

1. Preparar espacio de trabajo.

2. Esterilizar asa de siembra, enfriar en una zona sin colonias y coger inoculo bacterias.

3.  Depositar bacterias en la tira reactiva

Resultados e interpretación:

La tira no se ha coloreado de azul por lo que las pruebas serán negativas.

Práctica 13: Prueba de la catalasa

PRUEBA DE LA CATALASA

Objetivo:

La prueba consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una colonia bacteriana y observar si se forman burbujas.

Fundamento:

La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo.

El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de los hidratos de carbono.

La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndolo en agua y oxígeno gas. Si acumulase el peróxido de hidrógeno en los microorganismos, estos morirían, por ello es fundamental la presencia de microorganismos de la catalasa. El peróxido de hidrógeno se libera formando burbujas.

Material:

-       - Asa de siembra

-       - Mechero Bunsen

-       - Muestras 5 y 8

-       - Dos tubos de ensayo

-       - Peróxido de hidrógeno

-       - Dos portaobjetos

Procedimiento:

1  1. Preparar lugar de trabajo

2  2. Echar agua oxigenada en los tos tubos de ensayo y una gota en cada portaobjetos.

3  3. Esterilizar asa de siembra, enfrar en una esquina en la que no hayan colonias y coger bacterias.

   4. Depositar dentro del tubo de ensayo u homogeneizar en el portaobjetos con la gota. De ambas maneras es válida la prueba.

Resultados e interpretación:

No han salido burbujas en ninguna, por lo que la prueba será negativa.

Práctica 11: Antibiograma

ANTIBIOGRAMA

Objetivo:

Realizar un antibiograma en medio de cultivo Mueller Hinton. 

Fundamento:

Un antibiograma sirve para averiguar la sensibilidad de bacterias ante distintos tipos de antibióticos, y saber así cuales inhiben el crecimiento de dichas bacterias.

Material:

- Asa de siembra

- Gradilla

- Tubo de ensayo

- Gradilla

- Mechero Bunsen

- Bacterias 5 y 8

- Suero fisiológico

- Medio Mueller Hinton

- Asa de Digralsky

- Antibióticos

- Micropipeta

- Puntas de micropipeta

- Alcohol

- Vaso de precipitados

Procedimiento:

1.Echar en un tubo de ensayo suero fisiológico

2. Esterilizar asa de siembra, enfriar y coger inóculo.

3. Homogenizar inóculo con suero del tubo de ensayo, con la finalidad de que alcance la turbidez del tubo 0,5 de la escala de McFarland, si no lo hace, se siembra más muestra, y si hay demasiada turbidez, se añade suero fisiológico.

4. Rotular placa de Petri con Mueller Hinton.

5. Depositar 100 microlitros de la suspensión en la placa de Petri rotulada previamente.

6. Empapar asa de Digralsky con alcohol, prenderle fuego con el mechero para que quede esteril.

7. Realizar siembra en cesped con dicha asa, extendiendo la suspensión.

8. Depositar discos de antibióticos de manera equidistante.

9. Después de que crezcan, se mide el diámetro de los halos.

Resultados e interpretación:

Muestra 5:

- Clindamicina (CD): 3 cm = 30 mm

- Chlorarphenicol (C): 2,5 cm = 25 mm

- Neomycina (N): 1,5 cm = 15 mm

- Cefazolin (CZ): 0 cm

Sensible a clindamicina y a chlorarphenicol. Senbilidad media a neomycina. Resistente a cefazolin.

Muestra 8:

- Chorarphenicol (C): 2,3 cm = 23 mm

- Neomycina (N): 1,6 cm = 16 mm

- Cefazolin (CZ): 0 cm

- Penicilina (PG): 0 cm

Sensible a chlorarphenicol. Sensibilidad media a neomycina. Resistente a cefazolin y a penicilina.

Práctica 10: Escala de McFarland

ESCALA DE MCFARLAND

Fundamento:

La escala de McFarland se usa como referencia en suspensiones bacteriológicas, para saber el número de bacterias por milímetro, o más bien de UFC (unidad formadora de colonias), según una escala que va de 0.5 a 10. 

Consiste en unos patrones de turbidez basados en suspensiones de sulfato de bario. Dicha escala consta de 11 patrones, cada uno de los cuales tiene una turbidez comparable a la de una suspensión bacteriana con una densidad determinada.

Material:

- 11 tubos de ensayo

- Mechero Bunsen

- Pipetas de 5ml y 10 ml

- Cremallera

- Micropipetas

- Puntas de micropipeta

- Papel de filtro.

- Bata

- Guantes

- Cabina de bioseguridad

- Matraces

- Vaso de precipitados

Reactivos:

- Cloruro de bario.

- Ácido sulfúrico

Procedimiento:

1. Preparar las disoluciones correspondientes de cloruro de bario y de ácido sulfúrico, empezaremos por la de cloruro de bario.

2. Preparación de ácido sulfúrico:

Cálculos: 

V1 = 500/98 = 5,102 ml de ácido sulfúrico

500 - 5,102 = 494,897 ml de agua destilada

Coger un matraz de 500 ml, depositar en él un poco de agua destilada, 5 ml de ácido sulfúrico y enrasamos hasta 500 ml con agua destilada (495 ml), ya que lo queremos al 1%.

3. Preparación de cloruro de bario

- Pesar 0,587 gramos de cloruro de bario.

- En un matraz de 50 ml se echa agua destilada, y se añade el cloruro de sodio.

- Se enrasa hasta 50 ml con agua destilada (49,41 ml)

4. Rotular los 11 tubos en los que se va a realizar la escala: 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.

5- Echar en los tubos las siguientes cantidades:

- Tubo 0,5: 24,875 de ácido sulfúrico y 0,125 ml de cloruro de bario

- Tubo 1: 24,75 ml de ácido sulfurico y 0,25 ml de cloruro de bario.

- Tubo 2: 24,5 ml de ácido sulfurico y 0,50 ml de cloruro de bario.

- Tubo 3: 24,25 ml de ácido sulfurico y 0,75 ml de cloruro de bario.

- Tubo 4: 24 ml de ácido sulfurico y 1 ml de cloruro de bario.

- Tubo 5: 23,75 ml de ácido sulfurico y 1,25 ml de cloruro de bario.

- Tubo 6: 23,50 ml de ácido sulfurico y 1,50 ml de cloruro de bario.

- Tubo 7: 23,25 ml de ácido sulfurico y 1,75 ml de cloruro de bario.

- Tubo 8: 23 ml de ácido sulfurico y 2 ml de cloruro de bario.

- Tubo 9: 22,75 ml de ácido sulfurico y 2,25 ml de cloruro de bario.

- Tubo 10: 22,50 ml de ácido sulfurico y 2,50 ml de cloruro de bario.

- Tubo 11: 22,25 ml de ácido sulfurico y 2,75 ml de cloruro de bario.

Resultados:

Escala de McFarland con la que poder comparar la turbidez.